Když počátkem devadesátých let 15. století koupil zadlužené Pardubice s okolními panstvími zámožný moravský velmož Vilém z Pernštejna, zahájil tím nejen více než půlstoleté pernštejnské panování, ale také nejvýznamnější období v dějinách města i celého regionu, éru všeobecného rozkvětu.
Moravan Vilém, který se v té době stal nejvyšším hofmistrem království, se logicky snažil získat potřebné zázemí také v Čechách a Pardubicko se mu hodilo, protože odtud neměl tak daleko ani ke dvoru do Prahy, ani na své moravské statky. Navíc Viléma zaujala zdejší krajina jako stvořená pro budování rybníků, jichž tu pak v následujících dvaceti letech vzniklo přes dvě stě, což tehdy z Pardubicka učinilo jednu z největších rybníkářských oblastí v zemi. Dnes už to však není patrné, protože z někdejší soustavy rybníků se dochovaly jen malé zbytky.
Za centrum nového panství zvolil Vilém z Pernštejna Pardubice, do té doby málo rozvinuté městečko, které mohl snadno přetvořit v rezidenční město pernštejnského rodu, jednoho z nejbohatších a nejvlivnějších v zemi. Do roku 1506 získaly Pardubice status města a o šest let později jim Vilém vydal zvláštní městské zřízení. Město muselo tvořit hospodářské zázemí pernštejnského dvora a zároveň reprezentovat rezidenci předního velmože země. Vilémův záměr zásadní přestavby Pardubic urychlil velký požár v roce 1507. Nová honosná výstavba, která následovala, dala již v první třetině 16. století vzniknout úsloví "skví se jako Pardubice". Vilém rovněž nově vystavěl kostel sv. Bartoloměje, u něhož založil klášter minoritů. Kostel měl sloužit i jako rodová hrobka, z předních představitelů rodu tu byl ale nakonec pohřben jen Vilémův syn Vojtěch.
Důkladnou přestavbou prošel také starý vodní hrad, na jehož místě vyrostlo pohodlné pernštejnské sídlo chráněné mohutným hliněným valem, hradební zdí a širokým příkopem, který se dal podle potřeby zavodnit. V této unikátní podobě, která nemá v současné střední Evropě obdoby, se areál zámku dochoval dodnes.
V roce 1538 postihl Pardubice další zhoubný požár a jejich novou velkorysou přestavbu už v renesančním slohu podnikl Vilémův syn Jan. Domy byly zvýšeny o druhé patro a masově se na nich využilo terakotových ostění a portálů i obloučkových štítů, které se mnohdy zachovaly až do současnosti. Janův stavitel Jiřík Olomoucký také podstatně zvýšil věž Zelené brány a opatřil ji střechou z měděného plechu, jehož okysličením změněná barva dala věži název. Renesančnímu stylu se samozřejmě přizpůsobil i zámek, kde se z té doby dochovaly velmi cenné fragmenty nástěnných maleb, kazetové stropy či řada kamenických prvků včetně hlavního zámeckého portálu.
V další generaci však Pernštejnové nedokázali pardubické panství udržet, zadlužený Jaroslav z Pernštejna je roku 1560 prodal králi Ferdinandovi I. a od té doby se stalo císařsko-královským komorním statkem.
O původu rodu Pernštejnů a jejich erbu, na kterém je černá zubří hlava s kruhem v nozdrách na stříbrném, a později i zlatém štítu se dochovala pověst, kterou Pernštejnové prezentovali v podobě kamenných reliéfů na dominantních stavbách několika svých sídel. V Pardubicích ji dokonce nalezneme na třech místech. Podle pověsti žil kdysi v lesích na Moravě chudý uhlíř Vojtěch, kterému v prosté chýši někdo začal krást potravu. Jednou si Vojtěch počíhal na zloděje a s překvapením zjistil, že je to divoký zubr. Zvíře vší silou popadl za rohy, ale nevěděl, co si s ním dál počít. Až prý ptáček na stromě na něj pokřikoval“…lejčí, lejčí,…“ uhlíř pochopil a odmotal lýko, které měl kolem nohou jako svou obuv, upletl z něj houžev a prostrčil ji zubrovi skrz nozdry. Takto pokořené zvíře odvedl na knížecí hrad, kde mu před užaslými diváky usekl hlavu jednou ranou. Za tento hrdinský čin, kdy zbavil panství zběsilého zubra, dostal od svého pána do znaku černou zubří hlavu s kruhem v nozdrách a lesy, kde dříve pálil uhlí, aby si zde postavil hrad.